Флуоресценція у біологічних дослідженнях

Матеріал з Вікіпедії – вільної енциклопедії
Перейти до навігації Перейти до пошуку
Розподіл ракової клітини. Зображення отримано з використанням флуоресцентного мікроскопа, що сканує. Спеціальні методи введення флуоресцентних маркерів та використання кількох світлофільтрів дозволяють спостерігати одночасно за декількома об'єктами.

Флуоресценція знайшла широке застосування у різних прикладних біологічних та біомедичних дослідженнях [1] . Це фізичне явище, суть якого полягає в короткочасному поглинанні кванта світла флюорофором (речовиною, здатною флуоресціювати) з наступною швидкою емісією іншого кванта, який має властивості, відмінні від вихідного [2] . Багато напрямів у біофізиці , молекулярної та клітинної біології виникли та розвиваються саме завдяки впровадженню нових методів, що базуються на флуоресценції. Варто зазначити кілька прикладів.

Для біофізиків флуоресценція стала швидким та чутливим методом дослідження структури, динаміки та функцій біологічних макромолекулнуклеїнових кислот [3] та білків [4] .

Метод секвенування ДНК завдяки роботам Сенгера був значно удосконалений у другій половині 1980-х років саме завдяки впровадженню флуоресцентної детекції. Важливим наслідком цього стала висока швидкість та надійність секвенування. Крім того, метод був автоматизований [5] [6] . Це відкрило технічну можливість проведення широкомасштабного (за масштабами того часу) секвенування та дозволило розпочати проект «Геном людини» на початку 1990-х років. Хоча секвенування за Сенгер майже повністю вийшло з використання, флуоресценція продовжує використовуватися в методах секвенування ДНК наступних поколінь [7] [8] .

Флуоресценція дала новий поштовх розвитку клітинної біології. Завдяки конфокальній флуоресцентній мікроскопії та розробці нових флуоресцентних міток на базі зеленого флуоресцентного білка (ЗФБ) та його аналогів з'явилася можливість отримувати специфічно контрастне забарвлення та робити фотознімки з високою роздільною здатністю багатьох внутрішньоклітинних білкових структур. Розробка нових флуоресцентних зондів - речовин, що змінюють флуоресценцію, коли до них приєднується певна молекула - дала можливість детально досліджувати хімічний склад живих клітин і навіть організмів, а також його зміну в часі та просторі, що започаткувало флуоресцентний молекулярний іміджинг ( англ. molecular imag ) [9] [10]

Фізичні основи флуоресценції

Флуоресценція - це одне з явищ, які можуть відбуватися під час взаємодії електромагнітного випромінювання з речовиною.

Поглинання світла та флуоресценція

За нормальних умов переважна більшість молекул перебуває у основному електронному стані. Молекули можуть поглинати кванти електромагнітного випромінювання певної енергії та переходити у збуджений стан. Це відповідає переходу одного електрона з вищою зайнятою на найнижчу вільну молекулярну орбіталь . Відповідно до їх мультиплетності , основний і збуджений електронні стани позначають і . Порушення більшості флюорофорів ( ) відбувається під дією короткохвильового ультрафіолетового (довжина хвилі 300-400 нм) або видимого (довжина хвилі 400-800 нм) світла. Після переходу флюорофору у збуджений стан відбувається релаксація – процес, у якому молекула втрачає частину енергії; при цьому вона опускається до найнижчого коливального рівня електронного рівня . У рідкому середовищі за нормальних умов цей процес відбувається за час порядку кількох пікосекунд (10 -12 с). Згідно з правилом Каші саме з найнижчого коливального рівня електронного рівня відбувається перехід до основного електронного стану, що супроводжується флуоресценцією. Через втрату енергії під час релаксації та з деяких інших причин флуоресцентне випромінювання має меншу енергію (і відповідно більшу довжину хвилі ) порівняно зі світлом, яке поглинається під час збудження [2] .

Флуоресценцію можна спостерігати неозброєним оком . На знімку розчин перилену в дихлорметані під час опромінення довгохвильовим ультрафіолетом
Сильно спрощена схема спектрофлуориметра, приладу, за допомогою якого вивчають флуоресценцію

На малюнку, наведеному вище, не показані інші процеси, які конкурують із флуоресценцією. Зокрема, за час існування молекули у збудженому стані може відбутися внутрішня конверсія , тобто безвипромінний перехід . Існує також можливість переходу молекули в триплетний стан рахунок інтеркомбінаційної конверсії. Повну картину можливих переходів можна побачити на діаграмі Яблонського . Флуоресценцію не слід плутати з іншими типами люмінесценції , такими як фосфоресценція , хемолюмінесценція , біолюмінесценція тощо [11]

Детекція флуоресценції

У найпростішому випадку для спостереження флюоресценції потрібні лише розчин флуоресцентної сполуки та відповідне джерело світла для збудження. Зручним джерелом збудження є ультрафіолетові ручні лампи.

Основними приладами вивчення флуоресценції в лабораторних умовах є спектрофлуориметры [12] . Сильно спрощена схема такого приладу показана малюнку. У спектрофлуориметрах використовують різні джерела світла, найчастіше ксенонові лампи високого тиску. Вони дають широкий спектр емісії (від ультрафіолетового до інфрачервоного світла ). Випромінювання від лампи надходить до монохроматора збудження, який дає на виході світло з певною потрібною довжиною хвилі . Після цього монохроматичний промінь іде на зразок, викликаючи його флуоресценцію. Важливим є те, що флуоресцентна емісія ізотропна , тобто її інтенсивність однакова у всіх напрямках (не залежить від кута, під яким вона спостерігається). Це дає можливість легко відокремити її від збуджуючого світла. Розташування детектора під кутом 90 ° до напрямку збудження дає можливість вловлювати виключно фотони , які є результатом флуоресцентної емісії. Флуоресцентне світло пропускається крізь ще один монохроматор (монохроматор емісії, ). Після цього інтенсивність світлового потоку вимірюється детектором.

Перелічені тут компоненти (джерело світла, монохроматори, детектор) у різних варіантах та комбінаціях присутні у всіх приладах, що вимірюють флуоресценцію. Залежно від призначення приладу, конфігурація та характеристики кожного з елементів системи можуть змінюватись. Наприклад, замість монохроматорів можуть використовуватись набори світлофільтрів; як джерела монохроматичного світла можуть використовуватися лазери [1] .

Характеристики флуоресцентної емісії

Існує низка кількісних параметрів, що описують флуоресцентне випромінювання.

Параметр Позначення Опис
Інтенсивність флуоресценції , або Цей параметр є пропорційним кількості фотонів, які досягають детектора протягом одиниці часу. Він вимірюється у кількості фотонів на секунду (cps, counts per second) чи відносних одиницях (AU, arbitrary units). Цей параметр залежить як від досліджуваного зразка, і від приладу, у якому здійснюють виміри.
Спектр флуоресценції Спектр флуоресценції - це залежність інтенсивності флуоресценції від довжини хвилі детекції (λ em ), записана при стійкому значенні довжини хвилі збудження (λ ex ). У найпростішому випадку залежність має вигляд асиметричної кривої з одним максимумом. Позиція максимуму емісії показує, яким кольором флуоресціює з'єднання. Так, максимум флуоресценції при 450 нм приблизно відповідає синьому світлу, максимум при 650 нм означає червону флуоресценцію, і т. д. Ширина спектру флуоресценції органічних барвників становить від кількох десятків до кількох сотень нанометрів. Ширина спектру флуоресценції квантових точок менша і становить кілька десятків нанометрів.
Час життя флуоресценції Для кожного флуоресцентного з'єднання можна виміряти величину, яка має розмірність часу та має назву «час життя флуоресценції». Це величина порядку наносекунд для більшості флюорофорів . Вона показує усереднений час існування молекули у збудженому стані. Якщо побудувати графік загасання флуоресценції у часі, він матиме вигляд експоненційної кривої . У найпростішому випадку падіння буде моноекспоненцальним, тобто матиме вигляд прямий у логарифмічних координатах.
Час життя флуоресценції.jpg

Час життя в 1 нс означає, що флуоресценція зразка повністю зникне за одну наносекунду. Ця величина означає середній час існування збудженого флюорофора у великій популяції. Флуоресценція, подібно до радіоактивного розпаду, є стохастичним процесом. Тобто, кожна окремо взята молекула може випромінювати фотон за час як коротший, так і довший, ніж [1] .

Квантовий вихід флуоресценції Показує, яка частка поглинених фотонів випромінюється як флуоресценції. Як зазначалося вище, флуоресценція конкурує з низкою інших процесів, такими як внутрішня та інтеркомбінаційна конверсія . Крім них існує також можливість руйнування флюорофору шляхом хімічного перетворення (фотознебарвлення). Внаслідок цього кількість фотонів, що випромінюються внаслідок флуоресценції, завжди нижча, ніж кількість поглинених фотонів (Ф < 1).

Сумежні явища, важливі для біологічних застосувань

У дослідженнях біологічних систем є корисними деякі явища, пов'язані з флуоресценцією.

Явище Опис та основні характеристики
Анізотропія флуоресценції Показує, наскільки змінюється орієнтація збуджених молекул під час існування збудженого стану [1] [11] . Для вимірювання анізотропії флуоресценції необхідні спектрофлуориметри, обладнані поляризаторами збудливого та флуоресцентного світла. Знаючи інтенсивність флуоресцентного світла, поляризованого в паралельній та перпендикулярній площинах, анізотропію можна розрахувати за формулою:

Анізотропія флуоресценції показує, наскільки вільно обертається молекула під час існування збудженого стану. Вільні флюорофори в рідких розчинниках за нормальних умов обертаються швидко, що спричиняє повну деполяризацію (r = 0). Якщо флюорофор пов'язаний з великою біомолекулою , наприклад з білковою глобулою , такий комплекс обертається у просторі повільніше, що призводить до ненульових значень анізотропії. Теоретично можливий максимум дорівнює 0,4 [11] . Анізотропія флуоресценції широко використовується для вивчення білків та взаємодій між ними [13] .

Гасіння флуоресценції Іноді інтенсивність флуоресценції суттєво зменшується за наявності певних сполук у розчині. Таке явище називається гасіння флуоресценції , а сполуки, що його викликають - гасниками, тушітелями ( англ. quencher )
Схема гасіння флуоресценції.jpg

Класичним прикладом є кисень, який є гасником великої кількості органічних флюорофорів [1] . Математично гасіння флуоресценції описується рівнянням Штерна - Фольмера .

Тут - відношення початкової флуоресценції до флуоресценції у присутності гасника; - Константа Штерна - Фольмера; - Концентрація гасника.

Графік у координатах - називається графіком Штерна - Фольмера.

Гасіння буває статичним і динамічним. При статичному гасінні флюорофор в основному електронному стані утворює нефлуоресцентний комплекс із гасником. При динамічному гасінні утворюється звичайний збуджений стан, який руйнується гасителем ще до того, як встигає статися флуоресцентна емісія [1] .

Експерименти з гасінням флуоресценції триптофану акриламідом часто використовують для аналізу конформації білкових молекул [1] . Крім того, гасіння органічних флюорофорів використовується для розробки флуоресцентних зондів [11]

Ферстерівське резонансне перенесення енергії (ФРПЕ) Ферстерівське резонансне перенесення енергії (ФРПЕ) ( англ. Förster resonance energy transfer, FRET ) - процес, в якому бере участь два флюорофори, донор ( D ) і акцептор ( A ) переносу. Під час ФРПЕ відбувається перенесення енергії від одного флюорофору до іншого. Тобто, порушуючи одну молекулу (донор), можна спостерігати флуоресценцію з іншого (акцептора).
Fret — emission spectra scheme.svg

Для ФРПЕ необхідно дотримання кількох умов [1] , а саме:

  • спектр флуоресценції донора повинен перекриватися із спектром поглинання акцептора;
  • донор і акцептор повинні бути не далі певної відстані один від одного.
  • дипольні моменти донора та акцептора повинні мати певне взаємне розташування у просторі.

Важливим є те, що ФРПЕ відбувається на відстанях, які можна порівняти з розмірами біологічних об'єктів, таких як білкові глобули або мембрани клітин . При цьому відносна ефективність перенесення енергії залежить від відстані між ФРПЕ-партнерами. Ефективність ФРПЕ розраховується за такою формулою.

тут є Ферстерівським радіусом: такою відстанню між донором та акцептором, при якому ефективність перенесення дорівнює ½.

Якщо дві біомолекули, мічені ФРПЕ-парою, знаходяться на великій відстані, при збудженні донора спостерігатиметься лише його власна флуоресценція. Якщо молекули зближені в просторі, при збудженні донора буде спостерігатися емісія акцептора.

Схема залежності ФРПЕ від відстані.

Завдяки своїй залежності від відстані ФРПЕ став своєрідною «молекулярною лінійкою», яка дозволяє вимірювати відстань між молекулами, кожна з яких мічена одним із партнерів перенесення.

ФРПЕ може спостерігатися між різними за своєю хімічною природою флюорофорами; можливе також використання цього явища на рівні окремих молекул [14] або в розділеному форматі ( англ. time-resolved FRET ), що дає додаткову інформацію про динаміку та гетерогенність складних молекулярних систем [15] [16] .

Переваги флуоресцентних методів дослідження

Зображення окремих молекул жовтого флуоресцентного білка (YFP), отримане за допомогою флуоресцентної мікроскопії надвисокої роздільної здатності

Надвисока чутливість

За своєю чутливістю флуоресценція є абсолютним рекордсменом, перевершуючи методи детекції, що базуються на поглинанні світла або використання радіоактивного розпаду [1] . Сучасні інструменти можуть ідентифікувати флуоресцентні молекули. Це сприяло розвитку окремого напрямку - одномолекулярної флуоресцентної спектроскопії (ОФС, англ. Single Molecule Fluorescence Spectroscopy ) [17] [18] . Одномолекулярна флуоресцентна спектроскопія відкрила нові можливості вивчення біологічних систем на молекулярному рівні. Наприклад, класичні методи дослідження біомолекул , такі як спектроскопія ядерного магнітного резонансу , мають справу з великими зразками, що містять велику кількість молекул, тому весь час доводиться мати справу з усередненим сигналом. Інші методи, такі як електронна мікроскопія , дозволяють фізично спостерігати за окремими молекулами; однак такі методи не дають змоги вивчати їх у біологічно-релевантних умовах. Одномолекулярная флуоресцентная спектроскопия стала важным методом исследования, сочетающим возможность наблюдать за отдельными молекулами с возможностью исследовать их в динамике и при биологически-релевантных условиях. Например, именно благодаря ОФС стало возможным изучать сворачивание и динамику белков и ДНК на уровне отдельных молекул [14] [19] [20] [21] . Также на основе ОФС были созданы методы для секвенирования отдельных молекул ДНК и для наблюдения за отдельными флуоресцентными молекулами в клетке с использованием флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения [22] [23] . С помощью современных методов одномолекулярной микроскопии удаётся не только определить положение отдельных молекул в клетке с точностью до нескольких десятков нанометров (что значительно превосходит возможности традиционной световой микроскопии ), но и следить за их преобразованиями в реальном времени[24] .

Мультиплексность детекции

Существует большое количество флюорофоров , каждый из которых характеризуется определённым максимумом эмиссии (цветом флуоресценции). Это открывает возможность для мультиплексной детекции, то есть для наблюдения за несколькими объектами одновременно, если они закодированы флюорофорами с разными цветами эмиссии. Спектры эмиссии флюорофоров должны при этом не перекрываться. Если использовать флюорофоры с узкими спектрами, такие как квантовые точки , возможно наблюдать даже за пятью внутриклеточными целями одновременно[24] .

Трансгенные мыши, экспрессирующие ген усиленного зелёного флуоресцентного белка (eGFP)

Совместимость с живыми организмами

Существует возможность проводить исследования с использованием флуоресценции на живых клетках и даже целых организмах [10] . Видимый флуоресцентный свет не поглощается биологическими макромолекулами, водой и другими компонентами живых клеток и не влияет на процессы, происходящие в клетке.

За последние годы были разработаны многочисленные биосовместимые флюорофоры и флуоресцентные зонды. Среди них особенно выделяются флуоресцентные белки. Благодаря генной инженерии флуоресцентные белковые маркеры разных цветов могут быть присоединены к протеинам у различных лабораторных организмов ( англ. fusion proteins ). На фотографии справа изображены мыши, в геном которых был встроен ген eGFP — усиленного зелёного флуоресцентного белка .

При визуализации флуоресценции в живых тканях определённую проблему составляет поглощение света с короткими длинами волн. В связи с этим широкую популярность в качестве лабораторного организма получила Данио-рерио — маленькая аквариумная рыбка , которая является полностью прозрачной для видимого света на первых этапах развития. Это делает её удобным модельным организмом для исследований с использованием флуоресцентных меток и зондов [25] .

Данио-рерио — удобный модельный организм для исследований с использованием флуоресцентных меток и зондов [25]

Высокая скорость ответа

Флуоресценция является очень быстрым процессом, который происходит в наносекундной шкале времени (в случае отдельных комплексов металлов — в микросекундной). За секунду одна молекула флюорофора может излучить миллионы фотонов, каждый из которых содержит информацию об окружении, в котором находилась молекула непосредственно перед эмиссией [11] . Благодаря этому флуоресценцию удобно использовать для исследования быстрых процессов, таких как сворачивание и динамика отдельных белковых молекул [19] .

Высокое пространственное разрешение

Пространственное разрешение метода указывает, на каком минимальном расстоянии должны находиться объекты для того, чтобы их можно было однозначно различить. Пространственное разрешение очень важно в исследованиях живых систем на микроскопическом уровне. Линейный размер отдельных клеточных структур, таких как, например, ядерные поры, может составлять десятки нанометров, что делает их недосягаемыми для классической оптической микроскопии .

Благодаря некоторым особенностям процесса флуоресценции, таким как, например, возможности управляемо избавляться от нежелательной эмиссии на определённых участках образца с помощью дополнительного облучения ( англ. stimulated emission depletion ,) в конце XX века были разработаны методы оптической микроскопии сверхвысокого разрешения ( англ. super resolution microscopy ).

Если для конфокальной флуоресцентной микроскопии максимально достижимое пространственное разрешение составляет около 200 нм, для методов микроскопии сверхвысокого разрешения ( STED , PALM и т. д.) разрешающая способность достигает нескольких десятков нанометров [26] [27] .

Флюорофоры

Способностью флуоресценции обладают далеко не все химические соединения . Например, из двадцати протеиногенных аминокислот флуоресцентными свойствами обладают всего три: фенилаланин , тирозин , и триптофан [28] . Флуоресценция последнего широко используется для изучения конформаций, динамики и взаимодействий триптофансодержащих белков [1] [28] . Пуриновые и пиримидиновые азотистые основания, входящие в состав ДНК и РНК , почти не флуоресцируют при нормальных условиях [29] .

Существует большое разнообразие искусственных флуоресцентных соединений с различными фотофизическими свойствами [30] [31] [32] [33] . Основными классами являются малые органические красители, координационные соединения лантаноидов , флуоресцентные белки и полупроводниковые нанокристаллы. Каждый класс имеет свои специфические особенности, преимущества и недостатки.

Малые органические флюорофоры

Малые органические флюорофоры являются крупнейшим классом флуоресцентных соединений. В большинстве случаев это относительно небольшие органические вещества, содержащие несколько ароматических фрагментов . Молекулярная масса большинства органических флюорофоров меньше одного килодальтона [11] .

Флуоресцентными свойствами обладает чрезвычайно большое количество органических соединений . Практическое значение имеет только ограниченное их количество, — производные нескольких базовых структур [34] . Это производные кумарина , флуоресцеина [35] , родамина [35] [36] , борфторидных комплексов дипирролилметена BODIPY [37] , цианиновые [38] и сквариновые [39] красители.

Структурные формулы представителей основных классов флуоресцентных красителей : кумаринов ( 1 ), борфторидных комплексов дипирролилметена (BODIPY), 2 ), цианиновых красителей ( 3 ), флуоресцеинов ( 4 ), родаминов ( 5 ) и скваринов ( 6 )

Цвет флуоресценции малых органических красителей может варьироваться в очень широких пределах. Так, например, производные кумарина и флуоресцеина имеют синюю и зелёную флуоресценцию соответственно. Производные родамина и BODIPY могут иметь жёлто-красную флуоресценцию, тогда как на базе цианинов и скваринов созданы красители, которые флуоресцируют в красном и ближнем инфракрасном цвете . Флуоресценцией красителя можно управлять, изменяя природу функциональных групп, присоединённые к флюорофору [34] .

Флуоресцентные спектры красителей различного химического строения

Другой особенностью малых органических флюорофоров является то, что их флуоресценцию можно «включать» с помощью минимальных изменений в химической структуре. Это широко используется в создании флуоресцентных зондов на основе таких молекул. Примером является флуоресцеин , который может существовать в форме двух таутомеров : в нефлуоресцентной лактонной форме и флуоресцентной открытой форме.

Нефлуоресцентные соединения на основе «закрытой» формы способны превращаться во флуоресцентные под действием определённых химических веществ [40] .

Преобразование лактонной формы флуоресцеина (1) в открытую (2)

Существуют химические методы для выключения и включения флуоресценции других флюорофоров [41] . Подобные реагенты, которые увеличивают флуоресценцию в определённых условиях, называют «флуорогенными зондами» [42] .

Значительным преимуществом органических флюорофоров является возможность менять их фотофизические свойства с помощью варьирования функциональных групп . Другими преимуществами являются малый размер и возможность селективного ковалентного мечения биомолекул . Недостатками являются умеренные квантовые выходы флуоресценции, низкая яркость, низкая химическая стабильность и быстрое фотообесцвечивание под действием лазерного излучения [11] .

Недавно разработаны новые поколения флуоресцентных красителей с улучшенными свойствами [43] [44] . В исследованиях новых флюорофоров используются современные методы органической химии , такие как комбинаторный органический синтез [45] .

Координационные соединения

Флуоресцентные свойства присущи некоторым катионам металлов из группы лантаноидов (Ln 3+ ). За поглощение и излучение света этими атомами отвечают переходы электронов f-подуровня, которые в большинстве случаев являются квантовомеханически запрещёнными [11] . Поэтому флуоресценция лантаноидов имеет определённые особенности, в частности очень длинные времена жизни возбуждённого состояния, которые на 3-4 порядка выше, чем времена жизни органических флюорофоров. Из-за наличия нескольких возможных электронных переходов с разными энергиями, в спектрах флуоресценции лантаноидов наблюдается набор отдельных полос, характерных для каждого элемента. Цвет эмиссии может варьироваться от голубого ( Tm ) до инфракрасного ( Er ) [46] . Обычно лантаноиды используют в форме комплексов с органическими лигандами , которые повышают эффективность возбуждения атомов металла ( сенсибилизация ).

Флуоресцентные белки

Медуза Aequorea victoria , из которой впервые был выделен зелёный флуоресцентный белок , родоначальник большого семейства флуоресцентных белков

Важной группой флюорофоров являются флуоресцентные белки. Первый представитель этого класса — зелёный флуоресцентный белок (ЗФБ) — был выделен из медузы Aequorea victoria в 1962 году [47] . Это относительно небольшой белок с молекулярной массой 27 кДа, который поглощает синий свет и флуоресцирует зелёный.

В 1996-м году трёхмерная строение дикого ЗФБ и его мутантов было исследовано методом дифракции рентгеновских лучей [48] [49] . Было выяснено, что белок имеет структуру, подобную цилиндру, который образован несколькими бета-листами . В центре цилиндра расположен флюорофор, который образуется благодаря химической реакции между аминокислотными остатками серина , тирозина и глицина (аминокислоты 65-67).

Трёхмерная структура молекулы зелёного флуоресцентного белка и структурная формула его флюорофора

Исследования показали, что сворачивание полипептидной цепи ЗФБ в цилиндрическую структуру и образование функционального флюорофора является спонтанным процессом и не требует никаких посттрансляционных модификаций или кофакторов, кроме молекулярного кислорода [50] [51] . Как следствие, благодаря методам генной инженерии ЗФБ можно успешно экспрессировать во многих организмах, которые в естественном состоянии не имеют флуоресцентных белков.

Чашка Петри с бактериями, экспрессирующими 8 различных флуоресцентных белков.

Также была разработана технология использования ЗФБ в качестве маркерного протеина, который можно присоединить к другому внутриклеточному белку. Если совместить ген ЗФБ с геном, кодирующим определённый белок, после транскрипции и трансляции образуется новый гибридный протеин, состоящий из двух частей. При этом ЗФБ-часть самостоятельно превратится в компактную цилиндрическую структуру с флюорофором внутри. Поскольку ЗФБ является относительно небольшим биохимически инертным белком, он с высокой вероятностью не будет мешать своему «партнёру» выполнять свои функции в клетке. Но при этом вся гибридная конструкция будет ярко флуоресцировать, что даст возможность наблюдать за её возникновением и перемещениями [50] . Например, если ввести ген ЗФБ в гены, кодирующие белки цитоскелета , последний станет ярко флуоресцировать [52] .

Заменой отдельных аминокислот в диком ЗФБ методом мутагенеза были получены флуоресцентные белки с улучшенными свойствами. Например, изменение отдельных аминокислот из окружения флюорофора дало мутанты с другими цветами флуоресценции ( синим , жёлтым , красным и инфракрасным) [53] [54] . Также удалось получить варианты ЗФБ с меньшим временем образования флуоресцентной формы (созреванием), с более высокими фотостойкостью и квантовыми выходами флуоресценции.

Разработаны фотоактивационные флуоресцентные белки ( англ. photoswitchable fluorescent proteins ), которые можно «включать» и «выключать» облучением светом определённого цвета [55] [56] .

На базе флуоресцентных белков были разработаны генетически программируемые флуоресцентные сенсоры [57] [58] . Кроме того, флуоресцентные белки нашли широкое применение во флуоресцентной спектроскопии сверхвысокого разрешения [59] .

Революционное влияние флуоресцентных белков на современную биологию и биотехнологию было отмечено Нобелевской премией по химии 2008 года, которая была вручена Осаму Симомуре , Мартину Чалфи и Роджеру Тсиену [60] .

Флуоресцентные наночастицы и нанокластеры

Другой группой флуоресцентных соединений являются полупроводниковые нанокристаллы , или квантовые точки . При уменьшении физических размеров частиц полупроводника до нанометровых они начинают проявлять свойства, отличные от объёмных полупроводников. В частности, речь идёт о квантовых эффектах. При взаимодействии квантовой точки с электромагнитным излучением образуется экситон , который заперт в потенциальной яме. Рекомбинация экситона приводит к высвобождению энергии. Благодаря этому частицы нанометровых размеров, образованные из таких полупроводниковых веществ, как селенид кадмия (CdSe), способны поглощать свет и флуоресцировать [11] .

Суспензии флуоресцентных квантовых точек различных размеров. Диаметр частиц увеличивается слева направо.

Из-за различия в химическом строении и природе основного и возбуждённого электронного состояния, фотофизические свойства квантовых точек отличаются от свойств органических флюорофоров и флуоресцентных белков. Во-первых, квантовые точки дают узкий и симметричный спектр эмиссии , положение максимума которого зависит от диаметра квантовой точки и материала, из которого она образована. Если варьировать концентрацию реагентов при синтезе, можно добиться формирования квантовых точек преимущественно одного диаметра, которые будут иметь свой специфический цвет флуоресценции. Так, например, для CdSe изменение размера ядра от 13 до 24 нанометров приводит к изменению флуоресценции от голубой (λ em = 500 нм) до красной (λ em = 610 нм) [11] . Важным является то, что вид спектра возбуждения флуоресценции не зависит от диаметра; это означает, что можно добиться одновременного возбуждения различных типов квантовых точек, используя лишь одну волну возбуждения, что очень удобно для использования во флуоресцентной микроскопии .

Другими преимуществами квантовых точек над органическими флуоресцентными красителями являются высокие квантовые выходы флуоресценции и высокая устойчивость к фотообесцвечиванию [11] .

В то же время квантовые точки имеют и ряд недостатков. Во-первых, это большие физические размеры, превышающие величину большинства биологических молекул . Во-вторых, материалы, из которых изготавливаются квантовые точки ( Cd , Pb , Se , Hg ), очень токсичны для живых клеток и организмов [61] . Для уменьшения токсичности применяется многоступенчатый дизайн квантовых точек. Полупроводниковое ядро ( англ. core ) покрывается двойной защитной оболочкой из родственного материала (для селенида кадмия таким материалом является сульфид цинка ) и гидрофильной полимерной оболочкой, которая увеличивает растворимость квантовой точки в водной среде и даёт возможность химически привязывать к поверхности другие молекулы [62] .

Квантовые точки широко используются во флуоресцентной микроскопии и молекулярной диагностике in vitro [63] ; также разрабатываются методы для использования их в молекулярном имиджинге и диагностике in vivo .

Кроме квантовых точек, существуют другие флуоресцентные частицы нанометровых размеров. Примером являются кремниевые наночастицы с ковалентно привязанными к поверхности органическими красителями [64] , которые имеют существенно более низкую токсичность по сравнению с квантовыми точками. Известны также наночастицы, образованные из полимерных органических соединений [65] . Другим примером являются золотые и серебряные нанокластеры, синтезированные на матрице с ДНК , которые демонстрируют флуоресцентные свойства, состоя при этом всего из нескольких атомов металла [66] [67] .

Флуоресцентные зонды и метки

Флуоресцентные вещества, применяемые в биологии, можно условно разделить на две большие группы: флуоресцентные зонды и флуоресцентные метки [11] [68] :

  • Флуоресцентные метки служат для того, чтобы идентифицировать наличие или пространственное положение исследуемой молекулы. Флуоресцентная метка должна быть химически стабильной и демонстрировать стабильную флуоресценцию, которая не зависит от внешних факторов и минимально меняется во времени. Таким образом, она действует как пассивный «маяк», который сигнализирует о месте нахождения молекулы, к которой привязана.
  • Флуоресцентный зонд является более сложным по своим функциям. Это молекулярная конструкция, которая может существовать в двух состояниях: «выключенном» и «включённом». Эти состояния различаются между собой определёнными параметрами флуоресцентной эмиссии (чаще всего квантовым выходом флуоресценции, позицией максимума в спектре эмиссии или временем жизни возбуждённого состояния). Переход между «включён» и «выключен» состояниями зависит от наличия в среде зонда тех молекул, которые он должен распознавать.

Флуоресцентные метки

Наиболее распространёнными флуоресцентными метками в клеточной и молекулярной биологии являются флуоресцентные белки. Мечение зелёным флуоресцентным белком и его аналогами является рутинной процедурой, используемой при изучении структуры и функций белков в различных модельных организмах.

В наше время благодаря сочетанию технологий селективного ЗФБ-мечения белков, высокопроизводительной автоматической микроскопии и компьютерного анализа изображений возможно параллельное изучение локализации и функций сотен различных белков [69] .

Флуоресцентные белки невозможно напрямую использовать для ковалентного мечения нуклеиновых кислот . Для того чтобы исследовать ДНК и РНК с помощью флуоресцентных протеиновых маркеров, используют следующий приём. В цепь нуклеиновой кислоты вводят последовательность, с которой селективно связывается определённый протеин (репрессор, фактор транскрипции и т. д.). Сам протеин метят нужным флуоресцентным белком. Флуоресцентно-маркированные родственные белки ДНК и РНК связываются со своими мишенями, показывая их пространственную локализацию. Практическими реализациями этой стратегии является визуализация ДНК в эукариотических клетках с помощью ЗФБ лактозного репрессора ( англ. GFP-lac repressor ) [70] для визуализации РНК с помощью λ N системы [71] .

Флуоресцентные зонды

Согласно своему названию, флуоресцентный зонд имеет целью передавать исследователю информацию о среде, в которой он находится. Флуоресцентным зондом называется молекулярная конструкция, которая изменяет один из параметров флуоресценции (интенсивность, время жизни , максимум спектра флуоресценции), когда связывается со своей мишенью. Флуоресцентные зонды являются удобным инструментом для визуализации и квантификации распределения химических веществ , например сигнальных молекул в клетках [72] .

Возможный ответ флуоресцентного зонда на связывание с аналитом

Флуоресцентный зонд состоит из двух основных компонентов: 1) рецептора, который связывается с молекулой, которую надо обозначить (в аналитической химии её называют аналитом ); 2) флюорофора, который реагирует на изменение окружения, меняя флуоресценцию [11] . Существует большое количество механизмов, которые способны трансформировать связывание между рецептором и аналитом в изменение флуоресцентного сигнала. Например, при связывании рецептора с аналитом может варьироваться конформация молекулы, что приводит к удлинению или сокращению системы сопряжённых π-связей [73] . Изменение конформации молекулы может влиять на расстояние между ФРПЭ -парой, что также приведёт к заметным изменениям во флуоресценции. Образование новых координационных связей между рецептором и аналитом может активировать/блокировать перенос электрона в возбуждённом состоянии ( англ. photoinduced electron transfer ), что является одним из механизмов тушения флуоресценции [74] . Существуют также другие механизмы [75] .

Флуоресцентный зонд может по-разному изменять флуоресценцию при связывании с аналитом, что схематично показано на рисунке: флуоресценция может расти (случай А ), угасать ( В ) или полностью изменить один из параметров, например, цвет (случай С ).

Примерами для первого случая (рост флуоресценции в присутствии аналита) являются многочисленные производные флуоресцеина и родамина в закрытой лактонной форме. Раскрытие лактонов с образованием открытой флуоресцентной формы при реакции с такими веществами, как перекись водорода , сероводород или оксид азота (NO) является методом выявления этих биологически важных молекул в живых организмах [76] . Примером для второго случая (уменьшение флуоресценции при взаимодействии с аналитом) являются флуоресцентные зонды на хлорид -ионы: флуоресценция многих производных хинолина уменьшается в присутствии ионов хлора [1] . Наконец, примером для третьего случая является Fura-2, один из первых ратиометрических зондов для ионов кальция [77] , который меняет цвет флуоресценции при изменении концентрации ионов Ca 2+ в среде.

В некоторых случаях флуоресцентный зонд реагирует не на присутствие какого-то отдельного химического вещества, а изменение физических параметров среды, в которой он находится ( температура , полярность , вязкость ). Важным примером являются сольватохромные флуоресцентные красители — соединения, меняющие цвет флуоресценции в зависимости от полярности окружения. Сольватохромные флуоресцентные красители стали важным инструментом исследования липидного состава и фазовых переходов в липидных мембранах клеток [78] . Другая группа соединений, которую называют флуоресцентными молекулярными роторами , меняет интенсивность флуоресценции в зависимости от вязкости среды. Интенсивность флуоресценции очень низка в обычных растворителях, тогда как при высоких значениях динамической вязкости среды интенсивность флуоресценции возрастает в десятки раз [79] . С помощью флуоресцентных молекулярных роторов и конфокальной флуоресцентной микроскопии стало возможным исследовать вязкость среды внутри живых клеток [80] . В течение последних лет флуоресцентные зонды стали незаменимыми средствами исследования живых клеток, обогатив клеточную биологию новыми быстрыми и точными методами количественного анализа [81] [82] .

Примеры использования флуоресценции

Секвенирование ДНК

Секвенированием называют определение последовательности нуклеотидов в цепи нуклеиновой кислоты [83] . Первые методы секвенирования были разработаны в 1970-х годах XX столетия. Ими были метод химической деградации Максама — Гилберта [84] и метод, базирующийся на использовании дидезокситерминаторов по Сенгеру [85] . Суть последнего состояла в энзиматическом удлинении праймера (короткого олигонуклеотида -затравки известной структуры) на молекуле ДНК неизвестной последовательности в присутствии специальных химически-модифицированных нуклеозидов — дидезокситерминаторов. Они похожи на обычные нуклеозид-трифосфаты, которые являются исходными соединениями для синтеза ДНК в организме, но отличаются от них отсутствием 3'-гидроксильной группы. Эти химические соединения могут инкорпорироваться в последовательность ДНК, которая синтезируется ДНК-полимеразой . Но после инкорпорации дидезокситерминатора синтез обрывается из-за отсутствия свободного 3'-гидроксила для образования нового фосфодиэстерной связи с последующим нуклеозидом.

В оригинальном методе Сэнгера использовалось энзиматическое удлинение праймера , меченного радиоактивным изотопом ( 32 Р на 5'гидроксильной группе) в четырёх разных пробирках. К каждой из них добавлялся небольшой процент одного определённого дидезокситерминатора. Из-за этого синтез в каждой пробирке обрывался в определённый момент, но всегда на позиции того нуклеотида, который был в форме дидезокситерминатора. Кроме использования радиоактивных изотопов, другим недостатком этого метода было большое количество операций, необходимое для обнаружения и считывания радиоактивного сигнала, а также необходимость использования четырёх дорожек для каждого анализа, потому что невозможно было различить разные терминированные фрагменты только по их радиоактивности.

Флуоресцентные дидезокситерминаторы для автоматического секвенирования по Сенгеру

Метод секвенирования с дидезокситерминаторами был существенно усовершенствован, когда радиоактивное мечение праймера было заменено на флуоресцентное мечение терминальных нуклеотидов. На рисунке показана структура дидезоксинуклеозид-трифосфатов, которые содержат флуоресцентные красители, привязанные ковалентными связями к азотистым основаниям . Было обнаружено, что такие модификации азотистых оснований минимально влияют на распознавание трифосфатов ДНК-полимеразами , поэтому они могут встраиваться в синтезированную ДНК наряду с обычными дНТФ. В случае с флуоресцентными дидезокситерминаторами при терминации синтеза ДНК происходит её флуоресцентное мечение. Использование флуоресцентных красителей четырёх цветов для кодирования каждого из природных нуклеозидов позволило проводить синтез в одной пробирке и разделение на одной дорожке геля. Более того, флуоресцентная детекция оказалась более чувствительной и быстрой по сравнению с радиоактивной, позволяя проводить определение нуклеотидов в реальном времени.

В результате в конце 1980-х удалось разработать автоматические системы для секвенирования ДНК с разделением терминированных фрагментов в капиллярном варианте гель-электрофореза и с детекцией каждой «буквы» в последовательности по её специфическому цвету флуоресценции.

Хотя именно благодаря этому методу была расшифрована значительная часть ДНК человека, секвенирование по Сангеру уже не актуально из-за существования более быстрых, дешёвых и эффективных методов новых поколений. Многие из них также базируются на флуоресцентной детекции. Например, секвенирование с помощью синтеза ( англ. sequencing by synthesis ) также использует кодировку четырьмя разными цветами флуоресценции для каждой из четырёх букв генетического кода [86] .

Гибридизация ДНК

флуоресцентная гибридизация in situ между метафазными хромосомами и двумя ДНК-зондами , мечеными красным и зелёным цветами. Колокализация целевых фрагментов наблюдается в местах, которые флуоресцируют жёлтым

Молекулы ДНК состоят из двух цепей полинуклеотидов, которые комплементарны друг другу. Азотистые основания двух цепей образуют пары, которые стабилизированы водородными связями . Характерной чертой нуклеиновых кислот является способность к молекулярному узнаванию, благодаря которой одноцепные фрагменты ДНК имеют сродство с комплементарными фрагментами.

На основе явления гибридизации были созданы методы анализа последовательностей нуклеиновых кислот с использованием синтетических флуоресцентно-меченых олигонуклеотидов.

Одним из них является флюоресцентная гибридизация in situ ( англ. fluorescent in-situ hybridization, FISH ), которая используется для выявления точной локализации определённых последовательностей ДНК на метафазных хромосомах [1] . Во флуоресцентной гибридизации in situ используют синтетические олигонуклеотиды-зонды. Каждая последовательность-зонд ковалентно соединена с флюорофором определённого цвета. Такие зонды вводятся в клетки, после чего остаются на определённое время, для того чтобы состоялась гибридизация между зондами и комплементарными регионами хромосомной ДНК. Зонды, которые не гибридизировались, удаляются промыванием, после чего характерная окраска хромосом изучается с помощью флуоресцентной микроскопии .

Кроме локализации единичных генов на хромосомах, FISH позволяет исследовать колокализацию фрагментов ДНК. Благодаря этому метод полезен для цитологии и генетики . Так, если использовать для гибридизации с хромосомной ДНК два зонда, меченных красным и зелёным флюорофорами, места колокализации этих последовательностей на хромосомах будут выглядеть как жёлтые точки [1] .

Часто стоит задача определить, содержится ли последовательность ДНК нужной структуры в растворе , например в клеточном экстракте или в смеси продуктов полимеразной цепной реакции . Флюоресцентная гибридизация in situ для этого непригодна, потому что при связывании меченой ДНК с мишенью не произойдет изменения флуоресценции, а отделить связанный и несвязанный зонд, как в случае с хромосомами, невозможно из-за их одинаковой растворимости и других физико-химических свойств.

«Молекулярный маяк». Переход закрытой нефлуоресцентной формы (слева) в открытую флуоресцентную (справа) происходит в присутствии ДНК-мишени. F = флюорофор ; Q = гасители флуоресценции

Элегантный метод для решения этой задачи был найден в 1996-м году [87] и получил название «молекулярные маяки» ( англ. molecular beacons probes, MB-зонды , рус. ММ-зонды ). Структура и принцип работы ММ-зондов изображены на рисунке.

ММ-зонд является одноцепочечным фрагментом ДНК, состоящим из двух участков: петли ( на рис. красная) и основы (чёрная). Последовательность нуклеотидов в петле выбирается таким образом, чтобы быть комплементарным той последовательности, которую надо обозначить (мишени). Две части основы комплементарны друг другу, и поэтому образуют стабильную структуру при отсутствии мишени. Конечные гидроксильные группы одноцепочечной ДНК ковалентно модифицируются флюорофором (F) с одной стороны и гасителем флуоресценции (Q) с другой. При отсутствии мишени зонд находится в закрытом состоянии: флюорофор и гасители находятся друг возле друга, из-за чего флуоресценция «выключена». В присутствии ДНК-мишени может образовываться гибридная структура, в которой центральная петля комплементарна мишени, поэтому ММ-зонд «раскрывается». В таком состоянии концы, которые изначально образовывали основу зонда, оказываются разнесены на значительное расстояние в пространстве. Соответственно в таком состоянии гасители не могут эффективно гасить флюорофор, что приводит к значительному росту интенсивности флуоресценции [87] .

Оригинальный метод обозначения ДНК с помощью ММ-зондов претерпел многочисленные усовершенствования [88] . Например, существуют модификации, которые базируются на использовании резонансного переноса энергии. Вместо пары «флюорофор-гасители» концы одноцепочечного ДНК-зонда метят двумя флюорофорами, которые образуют ФРПЭ -пару; за счёт этого наличие ДНК-мишени можно определять по исчезновению флуоресценции акцептора и росту флуоресценции донора [89] [90] .

Важной областью применения ММ-зондов стала количественная полимеразная цепная реакция (ПЦР). ММ-зонд, комплементарный центральному региону последовательности, которая амплифицируется , добавляют в реакционную смесь до начала реакции . После старта реакции интенсивность флуоресценции измеряется на каждом цикле амплификации. Если в результате ПЦР амплифицируется фрагмент, комплементарный зонду, интенсивность флуоресценции растёт пропорционально концентрации продукта в смеси. Благодаря этому возможно оценить количество исходной ДНК, которое было в начале амплификации. Более того, возможно наблюдать за амплификацией нескольких вариантов последовательности ДНК в одной смеси, если использовать комбинацию ММ-зондов, закодированных разными цветами флуоресценции. Этот приём нашёл использование в генетическом анализе для идентификации различных аллелей одного гена [91] [92] .

Во флуоресцентной микроскопии ММ-зонды используются для изучения уровня экспрессии генов путём визуализации мРНК в цитоплазме . Когда определённый ген начинает транскрибироваться , в цитоплазме растёт концентрация соответствующей мРНК. Если синтезировать ММ-зонд с петлей, которая комплементарна участку мРНК, такой зонд будет гибридизироваться с ней, увеличивая при этом интенсивность своей флуоресценции. За счёт этого можно узнать локализацию соответствующей мРНК в клетке и оценить уровень экспрессии по росту флуоресценции [93] [94] [95] .

Микромассивы ДНК

В организмах высших эукариот содержатся тысячи генов, совокупная работа которых определяет фенотип организма. Для быстрого одновременного исследования большого количества генов была разработана технология микромассивов ДНК [96] .

Микромассив ДНК представляет собой твёрдую поверхность, на которую нанесено большое количество индивидуальных олигонуклеотидов . Каждый элемент массива на поверхности содержит ДНК одного определённого строения, которое программируется при создании массива. Одним из методов создания ДНК-микромассивов является химический твердофазный синтез ДНК с использованием фотоактивных защитных групп [97] .

ДНК-микромассив

Эта технология оказалась удобной для анализа уровня экспрессии генов в клетках. Для этого нужен ДНК-микромассив, содержащий набор олигонуклеотидных маркеров, специфических для каждого из генов, которые нужно исследовать. Для того, чтобы сравнить уровень экспрессии в двух образцах, контрольном и исследуемом, проводят следующие операции.

Клетки обоих образцов обрабатывают специальными химическими реагентами и экстрагируют матричную РНК, которая содержится в цитоплазме. РНК каждого образца инкубируют в присутствии обратной траскриптазы и флуоресцентных маркеров определённого цвета, в результате чего образуются флуоресцентно-меченые молекулы кДНК . Так, например, на рисунке, кДНК образца А была помечена красным флюорофором, а кДНК образец В — зелёным. После этого образцы смешивают и гибридизируют на микромассиве. В результате молекулы кДНК гибридизируются в ячейке, которая соответствует их гену. Анализ цвета флуоресценции в каждой ячейке показывает разницу в уровне экспрессии соответствующего гена в обоих образцах. Если ячейка имеет красный цвет, это значит что при гибридизации раствора на микромассиве в нём содержалось больше кДНК из клеток, А , следовательно уровень экспрессии гена в клетках А был более высоким. Если ячейка имеет зелёный цвет, значит уровень экспрессии был выше в клетках В . Наконец, жёлтый цвет свидетельствует о том, что клетки содержали одинаковое количество мРНК , следовательно уровень экспрессии этого гена у них был одинаковый [96] .

Флуоресцентная микроскопия

Общий вид флуоресцентного микроскопа «Олимпус» Бэ-Икс 61

Методы флуоресцентной окраски клеток

Низкомолекулярные органические флуоресцентные красители для клеточных органелл

Некоторые низкомолекулярные органические красители проявляют аффинность к определённым биомолекулам или целым клеточным органеллам . Это явление используется для селективной мультицветной окраски клеток во флуоресцентной микроскопии. Отдельные примеры красителей приведены в таблице.

Назва Структурная формула Цвет флуоресценции Что окрашивает
DAPI
4',6-диамидино-2-фенилиндол
DAPI.svg
синій ядерная ДНК
Hoechst 33342
Bisbenzimide.svg
синій ядерная ДНК
Нил красный (Nile Red)
Красный Нил структура.svg
червоний липофильные элементы клеток ( мембраны , липосомы )
MitoRed
МитоРэд.svg
червоний митохондрии

Одним из наиболее распространённых красителей для ядерной ДНК является 4',6-диамидино-2-фенилиндол, DAPI. Он способен селективно связываться с ДНК на А-Т обогащённых участках, демонстрируя яркую синюю флуоресценцию с максимумом на 461 нм [98] . Способность окрашивать хромосомную ДНК демонстрируют такие соединения, как Hoechst 33342, а также некоторые цианиновые красители [99] . Существуют также флуоресцентные красители, которые преимущественно окрашивают G-квадруплексы [100] .

Митохондрии обладают большим отрицательным мембранным потенциалом (около −180 mV), за счёт чего могут селективно окрашиваться катионными флуоресцентными красителями, такими как MitoRed [101] .

Иммунофлуоресцентное окрашивание

Окраска клеток с использованием органического красителя (синий цвет — окраска ядра DAPI) и иммунофлуоресцентной окраски (зелёный цвет — антитела к микротрубочкам , меченые флуоресцеином )

Существенным недостатком использования малых органических соединений в качестве флуоресцентных красителей является низкая селективность мечения клеточных компонентов. Например, соединения, которые связываются с хромосомной ДНК, могут в той или иной степени окрашивать другие нуклеиновые кислоты, содержащиеся в клетке; липофильные красители, окрашивающие липидные мембраны, могут также связываться с гидрофобными сайтами белков.

Селективного флуоресцентного мечения внутриклеточных структур можно достичь с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания клеток. Этот метод сочетает селективность традиционных методов иммуноокраски с чувствительностью флуоресцентной детекции.

Как и классическая иммуноокраска, этот метод базируется на использовании антител. Антитела — это белковые молекулы, которые с высокой афинностю и селективностью связываются со своими мишенями. Каждое антитело распознаёт свой определённый антиген .

При иммунофлуоресцентной окраске используют сразу два типа антител. Первичное антитело связывается непосредственно с объектом окраски. После этого вторичное антитело, которое ковалентно модифицировано молекулой флюорофора , связывается с первичным антителом. Таким образом, мишень, которая будет нести антиген, окрасится за счёт образования комплекса с двумя антителами [11] .

Использование двух антител, первичного и вторичного, необходимо для обеспечения гибкости метода, то есть ради возможности варьировать окраски различных мишеней без необходимости получения и химической модификации новых антител.

Недостатком иммунофлуоресцентной покраски является низкая проницаемость антител сквозь клеточные мембраны . Вследствие этого данный метод чаще всего используется для окраски фиксированных клеток.

Автофлуоресцентные белки

Генетически запрограммированные автофлуоресцентные белки, созданные на базе зелёного флуоресцентного белка (ЗФБ) и его аналогов, являются незаменимыми флуоресцентными маркерами клеточной и молекулярной биологии .

Преимуществами автофлуоресцентных белков является возможность их визуализации в клетке без введения каких-либо дополнительных красителей или химических реагентов . Генетическое мечение клеточных белков флуоресцентными белковыми маркерами можно реализовать, не меняя конформацию и биохимические свойства маркированного белка. Вследствие чего маркировка белков ЗФБ используется для изучения уровня экспрессии белков в клетках [102] .

Кроме пассивных флуоресцентных маркеров, которые просто сигнализируют о наличии и локализации белка, к которому они привязаны, на базе ЗФБ были созданы флуоресцентные зонды, которые меняют флуоресценцию в зависимости от концентрации ионов, сигнальных молекул и других факторов среды, в которой они находятся [103] .

В 2019 году сконструирован новый флуоресцентный белок CagFbFP, характеризующийся малым размером (он состоит из 107 аминокислот и имеет молекулярную массу 11,6 кДа) и термостабильностью (не меняет свойств до +68°С) [104] . Этот белок, благодаря его стабильности и простоте кристаллизации, является перспективной моделью для структурных исследований в качестве маркера для сверхточной флуоресцентной микроскопии высокого разрешения при исследовании злокачественных опухолей. Прототипом для синтеза нового флуоресцентного белка послужила термофильная бактерия Chloroflexus aggregans , найденная в горячих источниках острова Хонсю, обитающая в очень горячей воде с минимальными следами кислорода.

Флуоресцентный микроскоп

Упрощённая схема сканирующего конфокального эпифлуоресцентного микроскопа. Зелёные линии показывают путь возбуждающего света. Красные линии показывают путь флуоресцентного света

Для флуоресцентной микроскопии необходимы микроскопы специальной конструкции [105] . Сильно упрощённая схема такого микроскопа (а именно схема растрового конфокального эпифлуоресцентного микроскопа) показана на рисунке. Он имеет следующие особенности строения [11] [105] :

  • В качестве источников света используются лазеры или комбинация обычных источников света и монохроматоров . Это позволяет селективно облучать образец светом определённой длины волны для возбуждения флюорофоров одного типа.
  • Использование полупрозрачного зеркала упрощает конструкцию, позволяя использовать один и тот же оптический путь для возбуждающего (зёленые линии на рисунке) и флуоресцентного (красные линии) света. В отличие от классической микроскопии, в которой облучается весь образец одновременно, такие эпифлуоресцентные микроскопы направляют возбуждающий свет только на тот участок препарата, которая находится непосредственно в поле зрения. Все остальные части изображения остаются в темноте. Это позволяет минимизировать фотообесцвечивание неустойчивых флюорофоров и уменьшает фототоксические эффекты.
  • Качество изображений существенно улучшается при использовании конфокальных флуоресцентных микроскопов . В таких микроскопах на пути флуоресцентного света устанавливается щель, через которую удаётся наблюдать флуоресценцию только от той части образца, которая находится в фокусе изображения. С помощью конфокальных флуоресцентных микроскопов можно изменять глубину проникновения в клетку, наблюдая за отдельными её «срезами» (физически клетка остаётся целой). Это также позволяет сделать трёхмерную реконструкцию клетки, накопив достаточное количество оптических «срезов».
  • Использование фотомультипликатора в качестве детектора позволяет детектировать отдельные фотоны , что значительно повышает чувствительность метода.
  • В растровом флуоресцентном микроскопе изображение создаётся компьютером после сканирования образца. Свет лазера поочередно направляется в каждую точку изображения; при этом программное обеспечение микроскопа записывает интенсивность флуоресценции и соотносит её с координатами точки, из которой она была получена. После сканирования всех точек в поле зрения изображение реконструируется на экране компьютера.

Кроме растровых конфокальных микроскопов существуют другие типы этих приборов.

Флуоресцентная микроскопия сверхвысокого разрешения

Слева направо: 1) двумерная проекция возбуждающего лазерного импульса; 2) двумерная проекция STED импульса; 3) Зона возбуждения после наложения STED и возбуждающего импульсов
Сравнение разрешающей способности обычной конфокальной (левый верхний угол) и STED-микроскопии (правый нижний угол)

В растровом флуоресцентном конфокальном микроскопе изображение создаётся последовательным перемещением луча лазера от точки к точке кадра, регистрацией флуоресценции и последующей реконструкцией изображения на компьютере. Как оказалось, этот метод имеет некоторые недостатки. Явление дифракции накладывает определённые физические ограничения на минимальный размер сфокусированного лазерного луча, а следовательно, и на максимальное пространственное разрешение метода.

Впоследствии выяснилось, что этот дифракционный барьер может быть преодолён многими различными методами, что открывало возможности для оптической флуоресцентной микроскопии сверхвысокого разрешения [106] [107] .

Одним из первых способов стала STED-микроскопия (микроскопия на основе подавления спонтанного испускания). В основе этого метода лежит взаимодействие флюорофоров , возбуждённых обычным лазерным импульсом, с последующим STED-импульсом. Если возбуждённые молекулы флюорофора облучить электромагнитным импульсом , который по энергии соответствует ожидаемой энергии флуоресценции, происходит принудительное подавление эмиссии. Флюорофоры, которые попали под STED-импульс, не могут флуоресцировать. Если варьировать фазы возбуждающего и STED-импульсов, можно получить различную их локализацию в пространстве. Так, рисунок справа показывает проекцию начального лазерного импульса, форму STED-импульса, и участок, содержащий возбуждённые флюорофоры после наложения двух импульсов.

Благодаря этому была уменьшена площадь, с которой регистрируется флуоресценция, а следовательно, повышено пространственное разрешение метода. На фотографии слева показаны для сравнения два изображения одного и того же объекта, сделанные с использованием растровой конфокальной и STED-микроскопии.

Див. також

Примітки

  1. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Joseph R. Lakowicz Principles of Fluorescence Spectroscopy. — Springer Science+Business Media, 2006. — ISBN 978-0-387-31278-1
  2. 1 2 Bernard Valeur Molecular Fluorescence Principles and Applications. — Wiley-VCH Verlag GmbH. — ISBN 3-527-29919-X
  3. Millar, David P Fluorescence studies of DNA and RNA structure and dynamics // Current Opinion in Structural Biology 6 (1996) С. 322—326. DOI:10.1016/S0959-440X(96)80050-9.
  4. Royer, CA Probing Protein Folding and Conformational Transitions with Fluorescence // Chemical Reviews 106 (2006) (5) С. 1769—1784. DOI:10.1021/cr0404390.
  5. Smith, LM, Sanders, JZ, Kaiser, RJ, Hughes, P., Dodd, C., Connell, CR, Heiner, C., Kent, SBH, & Hood, LE (1986). Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis. Nature, 321(6071), 674—679.
  6. Prober, JM, Trainor, GL, Dam, RJ, Hobbs, FW, Robertson, CW, Zagursky, RJ, Cocuzza, AJ, Jensen, MA, & Baumeister, K. (1987). A system for rapid DNA sequencing with fluorescent chain-terminating dideoxynucleotides. Science, 238(4825), 336—341.
  7. Shendure, J., & Ji, H. (2008). Next-generation DNA sequencing. Nature Biotechnology, 26(10), 1135—1145.
  8. McGinn, S., & Gut, IG (2012). DNA sequencing — spanning the generations. New Biotechnology.
  9. Schepartz, A.; Gonzalez, RL Molecular imaging: sine labore nihil // Current Opinion in Chemical Biology 15 (2011) С. 749—751. DOI:10.1016/j.cbpa.2011.11.001.
  10. 1 2 Drummen, GPC Fluorescent Probes and Fluorescence (Microscopy) Techniques — Illuminating Biological and Biomedical Research // Molecules 17 (2012) С. 14067-14090. DOI:10.3390/molecules171214067.
  11. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Alexander P. Demchenko Introduction to Fluorescence Sensing. — Springer Science + Business Media BV, 2009. — ISBN 978-1-4020-9002-8
  12. Udenfriend, S. Development of the spectrophotofluorometer and its commercialization // Protein Science 4 (1995) (3) С. 542—551. DOI:10.1002/pro.5560040321.
  13. Е. В. Кудряшова, А. К. Гладилин, А. В. Левашов Белки в надмолекулярных ансамблях: исследование структуры методом разрешено-временной флуоресцентной анизотропии // Успехи биологической химии 42 (2002) С. 257—294.
  14. 1 2 Weiss, S. Measuring conformational dynamics of biomolecules by single molecule fluorescence spectroscopy // Nature Structural Biology 7 (2000) (9) С. 724—729. DOI:10.1038/78941.
  15. Selvin, PR The renaissance of fluorescence resonance energy transfer // Nature Structural Biology 7 (2000) (9) С. 730—734. DOI:10.1038/78948.
  16. Klostermeier, D., Millar, D. P Time-resolved fluorescence resonance energy transfer: A versatile tool for the analysis of nucleic acids // Biopolymers 61 (2002) (3) С. 159—179. DOI:10.1002/bip.10146.
  17. Ambrose, WP, Goodwin, PM, Jett, JH, Van Orden, A., Werner, JH, & Keller, RA Single Molecule Fluorescence Spectroscopy at Ambient Temperature // Chemical Reviews 99 (1999) (10) С. 2929—2956. DOI:10.1021/cr980132z.
  18. Tinnefeld, P., & Sauer, M. Branching Out of Single-Molecule Fluorescence Spectroscopy: Challenges for Chemistry and Influence on Biology. // Angewandte Chemie International Edition 44 (2005) С. 2642—2671. DOI:10.1002/anie.200300647.
  19. 1 2 Haran, G. Single-molecule fluorescence spectroscopy of biomolecular folding // Journal of Physics: Condensed Matter 15 (2003) С. 1292—1313. DOI:10.1088/0953-8984/15/32/201.
  20. Ha, T. Single-molecule fluorescence methods for the study of nucleic acids // Current Opinion in Structural Biology 11 (2001) С. 287—292. DOI:10.1016/S0959-440X(00)00204-9.
  21. Michalet, X., Weiss, S., & Jäger, M. Single-Molecule Fluorescence Studies of Protein Folding and Conformational Dynamics // Chemical Reviews 106 (2006) (5) С. 1785—1813. DOI:10.1021/cr0404343.
  22. Hohlbein, J., Gryte, K., Heilemann, M., & Kapanidis, AN Surfing on a new wave of single-molecule fluorescence methods // Physical Biology 7 (2010) (3) С. 031001. DOI:10.1088/1478-3975/7/3/031001.
  23. Moerner, WE; Fromm, DP Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy // Review of Scientific Instruments 74 (2003) С. 3597-3619. DOI:10.1063/1.1589587.
  24. 1 2 Persson, F., Barkefors, I., & Elf, J. Single molecule methods with applications in living cells // Current Opinion in Biotechnology 24 (2013) (4) С. 737—744. DOI:10.1016/j.copbio.2013.03.013.
  25. 1 2 Ko, S.-K.; Chen, X.; Yoon, J.; Shin, I. Zebrafish as a good vertebrate model for molecular imaging using fluorescent probes // Chemical Society Reviews 40 (2011) (5) С. 2120—2130. DOI:10.1039/c0cs00118j.
  26. Bo Huang Super-resolution optical microscopy: multiple choices // Current Opinion in Chemical Biology 14 (2010) (1) С. 10-14. DOI:10.1016/j.cbpa.2009.10.013.
  27. Lothar Schermelleh, Rainer Heintzmann, Heinrich Leonhardt A guide to super-resolution fluorescence microscopy // The Journal of Cell Biology 190 (2010) (2) С. 165. DOI:10.1083/jcb.201002018.
  28. 1 2 Alexander P. Demchenko Ultraviolet Spectroscopy of Proteins. — Springer, 1986. — ISBN 978-3-642-70849-7
  29. Crespo-Hernandez, CE; Cohen, B.; Hare, PM; Kohler, B. Ultrafast Excited-State Dynamics in Nucleic Acids // Chemical Reviews 104 (2004) (4) С. 1977—2020. DOI:10.1021/cr0206770.
  30. Waggoner, A. Fluorescent labels for proteomics and genomics // Current Opinion in Chemical Biology 10 (2006) (1) С. 62—66. DOI:10.1016/j.cbpa.2006.01.005.
  31. Du, W.; Wang, Y.; Luo, Q.; Liu, B.-F. Optical molecular imaging for systems biology: from molecule to organism // Analytical and Bioanalytical Chemistry 386 (2006) (3) С. 444—457. DOI:10.1007/s00216-006-0541-z.
  32. Lavis, LD Histochemistry: Live and in Color // Journal of Histochemistry & Cytochemistry 59 (2011) (2) С. 139—145. DOI:10.1369/0022155410395760.
  33. Ueno, T.; Nagano, T. Fluorescent probes for sensing and imaging // Nature Methods 8 (2011) С. 642—645. DOI:10.1038/nmeth.1663.
  34. 1 2 Lavis, LD; Raines, RT Bright Ideas for Chemical Biology // ACS Chemical Biology 3 (2008) (3) С. 142—155. DOI:10.1021/cb700248m.
  35. 1 2 Zheng, H.; Zhan, X.-Q.; Bian, Q.-N.; Zhang, X.-J. Advances in modifying fluorescein and rhodamine fluorophores as fluorescent chemosensors // Chemical Communications 49 (2012) С. 429—447. DOI:10.1039/c2cc35997a.
  36. Beija, M.; Afonso, CAM; Martinho, JMG Synthesis and applications of Rhodamine derivatives as fluorescent probes // Chemical Society Reviews 38 (2009) (8) С. 2410—2433. DOI:10.1039/B901612K.
  37. Boens, N.; Leen, V.; Dehaen, W. Fluorescent indicators based on BODIPY // Chemical Society Reviews 41 (2012) С. 1130—1172.
  38. Tatikolov, AS Polymethine dyes as spectral-fluorescent probes for biomacromolecules // Journal of Photochemistry and Photobiology C: Photochemistry Reviews 13 (2012) (1) С. 55-90. DOI:10.1016/j.jphotochemrev.2011.11.001.
  39. Beverina, L.; Salice, P. Squaraine Compounds: Tailored Design and Synthesis towards a Variety of Material Science Applications // European Journal of Organic Chemistry (2010) С. 1207—1225. DOI:10.1002/ejoc.200901297.
  40. Chen, X.; Pradhan, T.; Wang, F.; Kim, JS; Yoon, J. Fluorescent Chemosensors Based on Spiroring-Opening of Xanthenes and Related Derivatives // Chemical Reviews 112 (2012) С. 1910—1956. DOI:10.1021/cr200201z.
  41. Yuan, L.; Lin, W.; Zheng, K.; He, L.; Huang, W. Far-red to near infrared analyte-responsive fluorescent probes based on organic fluorophore platforms for fluorescence imaging // Chemical Society Reviews 42 (2013) С. 622—661. DOI:10.1039/C2CS35313J.
  42. Grimm, JB; Heckman, LM; Lavis, LD; May, CM The Chemistry of Small-Molecule Fluorogenic Probes // Progress in Molecular Biology and Translational Science 113 (2013) С. 1-13. DOI:10.1016/B978-0-12-386932-6.00001-6.
  43. Wysocki, LM; Lavis, LD Advances in the chemistry of small molecule fluorescent probes // Current Opinion in Chemical Biology 15 (2011) (6) С. 752—759. DOI:10.1016/j.cbpa.2011.10.013.
  44. Sun, Y.-Q.; Liu, J.; Lv, X.; Liu, Y.; Zhao, Y.; Guo, W. Rhodamine-Inspired Far-Red to Near-Infrared Dyes and Their Application as Fluorescence Probes // Angewandte Chemie International Edition 51 (2012) (31) С. 7634-7636. DOI:10.1002/anie.201202264.
  45. Finney, NS Combinatorial discovery of fluorophores and fluorescent probes // Current Opinion in Chemical Biology 10 (2006) (3) С. 238—245. DOI:10.1016/j.cbpa.2006.04.025.
  46. Bünzli, J.-C. G Lanthanide Luminescence for Biomedical Analyses and Imaging // Chemical Reviews 110 С. 2729—2755. DOI:10.1021/cr900362e.
  47. Shimomura O, Johnson F, Saiga Y (1962). «Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea». J Cell Comp Physiol 59 (3): 223-39. doi:10.1002/jcp.1030590302.
  48. Ormö M, Cubitt A, Kallio K, Gross L, Tsien R, Remington S Crystal structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein // Science 273 (1996) С. 1392—1395. DOI:10.1126/science.273.5280.1392.
  49. Yang F, Moss L, Phillips G The molecular structure of green fluorescent protein // Nature Biotechnology 14 (1996) (10) С. 1246—1251. DOI:10.1038/nbt1096-1246.
  50. 1 2 Tsien, RY The Green Fluorescent Protein // Annual Review of Biochemistry 67 (1998) (1) С. 509—544. DOI:10.1146/annurev.biochem.67.1.509.
  51. Zimmer, M. Green Fluorescent Protein (GFP): Applications, Structure, and Related Photophysical Behavior // Chemical Reviews 102 (2002) (3) С. 759—782. DOI:10.1021/cr010142r.
  52. Beat Ludin, Andrew Matus GFP illuminates the cytoskeleton // Trends in Cell Biology 8 (1998) (2) С. 72-77. DOI:10.1016/S0962-8924(98)80015-9.
  53. Tsien, RY Building and breeding molecules to spy on cells and tumors // FEBS Letters 579 (2005) (4) С. 927—932. DOI:10.1016/j.febslet.2004.11.025.
  54. Giepmans, BNG, Adams, SR, Ellisman, MH, & Tsien, RY (2006). The Fluorescent Toolbox for Assessing Protein Location and Function. Science, 312(5771), 217—224.
  55. Stepanenko, OV; Stepanenko, OV; Shcherbakova, DM; Kuznetsova, IM; Turoverov, К. К.; Verkhusha, VV Modern f luorescent proteins: from chromophore formation to novel intracellular applications // BioTechniques 51 (2011) С. 313—327. DOI:10.2144/000113765.
  56. Zhou, XX; Lin, MZ Photoswitchable fluorescent proteins: ten years of colorful chemistry and exciting applications // Current Opinion in Chemical Biology 17 (2013) (4) С. 682—690. DOI:10.1016/j.cbpa.2013.05.031.
  57. Ohba, Y., Fujioka, Y., Nakada, S., Tsuda, M., & May, CM Fluorescent Protein-Based Biosensors and Their Clinical Applications. // Progress in Molecular Biology and Translational Science 113 (2013) С. 313—348. DOI:10.1016/B978-0-12-386932-6.00008-9.
  58. VanEngelenburg, SB; Palmer, AE, Fluorescent biosensors of protein function // Current Opinion in Chemical Biology 12 (2008) С. 60-65. DOI:10.1016/j.cbpa.2008.01.020.
  59. Tiwari, DK; Nagai, T. Smart fluorescent proteins: Innovation for barrier-free superresolution imaging in living cells // Development, Growth & Differentiation 55 (2013) (4) С. 491—507. DOI:10.1111/dgd.12064.
  60. The Nobel Prize in Chemistry 2008
  61. Jyoti K. Jaiswal, Sanford M. Simon Potentials and pitfalls of fluorescent quantum dots for biological imaging // Trends in Cell Biology 14 (2004) (9) С. 497—504. DOI:10.1016/j.tcb.2004.07.012.
  62. Biju, V., Itoh, T., & Ishikawa, M. (2010). Delivering quantum dots to cells: bioconjugated quantum dots for targeted and nonspecific extracellular and intracellular imaging. Chemical Society Reviews, 39(8), 3031-3056.
  63. Jin, Z., & Hildebrandt, N. (2012). Semiconductor quantum dots for in vitro diagnostics and cellular imaging. Trends in Biotechnology.
  64. Vivero-Escoto, JL, Huxford-Phillips, RC, & Lin, W. Silica-based nanoprobes for biomedical imaging and theranostic applications. // Chem. Soc. Rev. 41 (2012) С. 2673—2685. DOI:10.1039/c2cs15229k.
  65. Wu, C.; Chiu, DT Highly Fluorescent Semiconducting Polymer Dots for Biology and Medicine // Angewandte Chemie International Edition 52 (2013) С. 3086-3109. DOI:10.1002/anie.201205133.
  66. Han, B., & Wang, E. DNA-templated fluorescent silver nanoclusters // Analytical and Bioanalytical Chemistry 402 (2012) (1) С. 129—138. DOI:10.1007/s00216-011-5307-6.
  67. Shiang, Y.-C.; Huang, C.-C.; Chen, W.-Y.; Chen, P.-C.; Chang, H.-T. Fluorescent gold and silver nanoclusters for the analysis of biopolymers and cell imaging // Journal of Materials Chemistry 22 (2012) С. 12972-12982. DOI:10.1039/c2jm30563a.
  68. Lemke, EA; Schultz, C. Principles for designing fluorescent sensors and reporters // Nature Chemical Biology 7 (2011) С. 480—483. DOI:10.1038/nchembio.620.
  69. JC Simpson, B. Joggerst, V. Laketa, F. Verissimo, C. Cetin, H. Erfle, MG Bexiga, VR Singan, J.-K. Hériché, B. Neumann, A. Mateos, J. Blake, S. Bechtel, V. Benes, S. Wiemann, J. Ellenberg, R. Pepperkok Genome-wide RNAi screening identifies human proteins with a regulatory function in the early secretory pathway // Nature Cell Biology 14 (2012) С. 764—774. DOI:10.1038/ncb2510.
  70. Susan M. Gasser Visualizing Chromatin Dynamics in Interphase Nuclei // Science 2002 (2002) (296) С. 1412—1416. DOI:10.1126/science.1067703.
  71. Nathalie Daigle, Jan Ellenberg λN-GFP: an RNA reporter system for live-cell imaging // NATURE METHODS 4 (2007) (8) С. 633—636. DOI:10.1038/NMETH1065.
  72. Johnson, I. Fluorescent probes for living cells // The Histochemical Journal 30 (1998) (3) С. 123—140. DOI:10.1023/a:1003287101868.
  73. Shi, W.; Ma, H. Spectroscopic probes with changeable π-conjugated systems // Chemical Communications 48 (2012) С. 8732-8744. DOI:10.1039/c2cc33366j.
  74. Liu, Z.; He, W.; Guo, Z. Metal coordination in photoluminescent sensing // Chemical Society Reviews 42 (2013) (4) С. 1568—1600. DOI:10.1039/c2cs35363f.
  75. de Silva, AP, Gunaratne, HQN, Gunnlaugsson, T., Huxley, AJM, McCoy, CP, Rademacher, JT, & Rice, TE Signaling Recognition Events with Fluorescent Sensors and Switches // Chemical Reviews 97 (1997) (5) С. 1515—1566. DOI:10.1021/cr960386p.
  76. Chan, J.; Dodani, SC; Chang, CJ Reaction-based small-molecule fuorescent probes for chemoselective bioimaging // Nature Chemistry 4 (2012) С. 973—984. DOI:10.1038/NCHEM.1500.
  77. Grynkiewicz, G.; Poenie, M.; Tsien, RY A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties // Journal of Biological Chemistry 260 (1985) С. 3440-3450.
  78. Demchenko, AP; Mély, Y.; Duportail, G.; Klymchenko, AS Monitoring Biophysical Properties of Lipid Membranes by Environment-Sensitive Fluorescent Probes // Biophysical Journal 96 (2009) (9) С. 3461-3470. DOI:10.1016/j.bpj.2009.02.012.
  79. Haidekker, MA; Theodorakis, EA Molecular rotors—fluorescent biosensors for viscosity and flow // Organic & Biomolecular Chemistry 5 (2007) С. 1669—1678. DOI:10.1039/b618415d.
  80. Kuimova, MK Mapping viscosity in cells using molecular rotors // Physical Chemistry Chemical Physics 14 (2012) С. 12671-12686. DOI:10.1039/c2cp41674c.
  81. Johnsson, N.; Johnsson, K. Chemical Tools for Biomolecular Imaging // ACS Chemical Biology 2 (2007) (1) С. 31-38. DOI:10.1021/cb6003977.
  82. Terai, T.; Nagano, T. Fluorescent probes for bioimaging applications // Current Opinion in Chemical Biology 12 (2008) (515—521). DOI:10.1016/j.cbpa.2008.08.007.
  83. Franca, LTC, Carrilho, E., & Kist, TBL A review of DNA sequencing techniques // Quarterly Reviews of Biophysics 35 (2002) (02) С. 169—200. DOI:10.1017/S0033583502003797.
  84. Maxam, AM; Gilbert, W. A new method for sequencing DNA // Proceedings of the National Academy of Sciences 74 (1977) (2) С. 560—564.
  85. Sanger, F.; Nicklen, S.; Coulson, AR DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proceedings of the National Academy of Sciences 74 (1977) (12) С. 5463-5467.
  86. Ju, J.; Kim, DH; Bi, L.; Meng, Q.; Bai, X.; Li, Z.; Li, X.; Marma, MS; Shi, S.; Wu, J.; Edwards, JR; Romu, A.; Turro, NJ Four-color DNA sequencing by synthesis using cleavable fluorescent nucleotide reversible terminators // Proceedings of the National Academy of Sciences 103 (2006) (52) С. 19635-19640. DOI:10.1073/pnas.0609513103.
  87. 1 2 Tyagi, S.; Kramer, FR Molecular Beacons: Probes that Fluoresce upon Hybridization // Nature Biotechnology 14 (3) С. 303—308. DOI:10.1038/nbt0396-303.
  88. Guo, J.; Ju, J.; Turro, N., Fluorescent hybridization probes for nucleic acid detection. // Analytical and Bioanalytical Chemistry 402 (2011) (10) С. 3115-3125. DOI:10.1007/s00216-011-5526-x.
  89. Didenko, VV DNA Probes Using Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET): Designs and Applications Архивная копия от 7 октября 2013 на Wayback Machine (pdf) // BioTechniques 31 (2001) С. 1106—1121.
  90. Juskowiak, B. Nucleic acid-based fluorescent probes and their analytical potential // Analytical and Bioanalytical Chemistry 399 (9) С. 3157-3176. DOI:10.1007/s00216-010-4304-5.
  91. Tyagi S, Bratu DP, Kramer FR Multicolor molecular beacons for allele discrimination // Nature Biotechnology 16 (1998) С. 49 — 53. DOI:10.1038/nbt0198-49.
  92. Ranasinghe, RT; Brown, T. Fluorescence based strategies for genetic analysis // Chemical Communications (2005) С. 5487-5502. DOI:10.1039/b509522k.
  93. Silverman, AP; Kool, ET Quenched probes for highly specific detection of cellular RNAs // Trends in Biotechnology 23 (2005) (5) С. 225—230. DOI:10.1016/j.tibtech.2005.03.007.
  94. Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells // Nature Methods 6 (2009) (5) С. 331—338. DOI:10.1038/nmeth.1321.
  95. Wang, K.; Huang, J.; Yang, X.; He, X.; Liu, J. Recent advances in fluorescent nucleic acid probes for living cell studies // Analyst 138 (2013) С. 62-71. DOI:10.1039/c2an35254k.
  96. 1 2 Sassolas, A.; Leca-Bouvier, BD; Blum, LJ DNA Biosensors and Microarrays // Chemical Reviews 108 (2008) С. 109−139. DOI:10.1021/cr0684467.
  97. Pirrung, MC Spatially Addressable Combinatorial Libraries // Chemical Reviews 97 (1997) (2) С. 473—488. DOI:10.1021/cr960013o.
  98. Kapuscinski, J. DAPI: a DNA-Specific Fluorescent Probe // Biotechnic & Histochemistry 70 (1995) (5) С. 220—233. DOI:10.3109/10520299509108199.
  99. Yarmoluk, SM; Kovalska, VB; Losytskyy, MY Symmetric cyanine dyes for detecting nucleic acids // Biotechnic & Histochemistry 83 (2008) С. 131—145. DOI:10.1080/10520290802383684.
  100. Vummidi, BR; Alzeer, J.; Luedtke, NW Fluorescent Probes for G-Quadruplex Structures // ChemBioChem 14 (2013) (5) С. 540—558. DOI:10.1002/cbic.201200612.
  101. Neto, BAD; Correa, JR; Silva, RG, Selective mitochondrial staining with small fluorescent probes: importance, design, synthesis, challenges and trends for new markers. // RSC Advances 3 (2013) С. 5291-5301. DOI:10.1039/c2ra21995f.
  102. Wahlfors, J.; Loimas, S.; Pasanen, T.; Hakkarainen, T. Green fluorescent protein (GFP) fusion constructs in gene therapy research // Histochemistry and Cell Biology 115 (2001) С. 59-65. DOI:10.1007/s004180000219.
  103. Zhang, J.; Campbell, RE; Ting, AY; Tsien, RY Creating new fluorescent probes for cell biology // Nature Reviews Molecular Cell Biology 3 (2002) (12) С. 906—918. DOI:10.1038/nrm976.
  104. Ivan Gushchin, Valentin Gordeliy, Ulrich Krauss, Karl-Erich Jaeger, Mehdi D. Davari. A thermostable flavin-based fluorescent protein from Chloroflexus aggregans: a framework for ultra-high resolution structural studies (англ.) // Photochemical & Photobiological Sciences. - 2019-05-01. — ISSN 1474-9092 . — doi : 10.1039/C9PP00067D .
  105. 1 2 Lichtman, JW; Conchello, J.-A. Fluorescence microscopy // Nature Methods 2 (2005) (12) С. 910—919. DOI:10.1038/nmeth817.
  106. Bo Huang, Hazen Babcock, Xiaowei Zhuang Breaking the Diffraction Barrier: Super-Resolution Imaging of Cells // Cell 143 (2010) С. 1047—1058. DOI:10.1016/j.cell.2010.12.002.
  107. Hell, SW Far-Field Optical Nanoscopy // Science 316 (2007) С. 1153—1158. DOI:10.1126/science.1137395.

Література

Посилання